银染mRNA差异显示方法的建立和二次扩增参数优化

摘要

目的 优化银染差异显示（ＤＤ－ＰＣＲ）条件和二次ＰＣＲ扩增参数，建立非放射性ＤＤ－ＰＣＲ方法。方法 采用单碱基锚定引物与１０碱基随机引物组合，对大细胞肺癌细胞系８０１－Ｄ总ＲＮＡ模板进行ＤＤＲＴ－ＰＣＲ，行小体积测序胶电泳，银染呈现扩增产物，在胶上直接切取差异条带后，进行再扩增。结果 银染ＤＤ－ＰＣＲ条件经最适化后，可显著足够数量的条带。随机引物５’末端出现ＧＣ扩增效果明显优于３’末端ＧＣ的出现，银染ＤＤ－ＰＣＲ中ｄＮＴＰｓ需要高浓度。差异条带再扩增时，低浓度上下游引物可防止非特异性扩增。结论 银染差异显示方法简便有效，完全适用于一般的科研应用。