急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体cDNA实时定量PCR标准品及标准曲线的构建

摘要

目的 克隆急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA作为实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测PML-RARα融合基因的标准品,从而构建FQ-PCR检测标准曲线.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从急性早幼粒白血病患者骨髓单个核细胞的总RNA中逆转录扩增的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA,将纯化的PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA与pMD18-T载体进行连接,转化宿主菌E.coli DH5a感受态细胞,氨苄青霉素培养基筛选阳性克隆,提取重组质粒cDNA用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ、EcoR工进行双酶切鉴定并测序分析,最后进行实时荧光定量PCR检测.通过检测重组质粒260 nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR标准品.结果 酶切鉴定、PCR扩增及测序分析均证实PML-RARα融合基因重组到pMD18-T载体.结论 成功克隆急性早幼粒白血病PML-RARα融合基因异构体L型、S型cDNA.