毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化途径及C-糖基转移酶的分析

摘要

[目的] 毛竹叶中含有大量具有很强生物活性的黄酮碳苷,C-糖基转移酶(CGT)是黄酮碳苷生物合成代谢途径中C-糖基化的关键酶.本研究从毛竹叶中分离纯化CGT,研究毛竹叶黄酮碳苷的C-糖基化途径以及CGT的酶学性质和一级结构氨基酸序列特征,为后续深入研究毛竹叶中的CGT奠定良好的基础.[方法] 通过硫酸铵分层沉淀、透析、葡聚糖凝胶过滤、阴离子交换层析、超滤脱盐等方法纯化CGT,使用SDS-PAGE进行检测.分别用圣草素查尔酮、圣草素、木犀草素作为底物,根据已建立的CGT催化的C-糖基化反应体系,进行可能的C-糖基化途径验证.运用Q-TOF检测分析和数据库搜索比对等方法,确认毛竹CGT的基因序列和一级结构氨基酸序列.[结果] 毛竹叶黄酮碳苷CGT的分子量大约是50 kDa,酶反应体系最佳的反应时间是40 min,最佳反应温度是28 ℃,缓冲盐的最佳pH8. 1,底物木犀草素的最佳浓度是31. 76 μmol·L-1.底物为木犀草素的反应体系在CGT催化下大量转化生成了异荭草苷,底物为圣草素查尔酮和圣草素的反应体系在CGT催化下大量转化生成了未知产物,只有少量转化生成异荭草苷.根据蛋白质质谱裂解规律和蛋白质碎片离子,解析出4个CGT肽段,并均可与毛竹基因(PH01000603G0510)编码的蛋白质氨基酸序列匹配,经数据搜索匹配,毛竹基因(PH01000603G0510)与水稻CGT基因(FM179712)匹配率为81%.[结论] 通过对毛竹叶黄酮碳苷C-糖基转移酶提取、分离纯化及质谱鉴定得到可能的毛竹叶黄酮碳苷CGT基因序列(PH01000603G0510).确定毛竹叶黄酮碳苷C-糖基化途径,主要途径是CGT催化木犀草素和UDP-葡萄糖直接合成异荭草苷,次要途径是CGT催化圣草素查尔酮和UDP-葡萄糖,或圣草素和UDP-葡萄糖间接合成异荭草苷.毛竹叶CGT极易催化生成C-6黄酮苷(异荭草苷),而极少催化生成C-8黄酮苷(荭草苷).