LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

摘要

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用,为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2)分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48%(P<0.05)和52%(P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍(P<0.01);过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1(P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌(P<0.05)。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。