藏绵羊BOLL的分子特征及其在睾丸中的表达调控与功能分析

摘要

[目的]BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用.研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解.[方法]选取3月龄(性成熟前)、1岁龄(性成熟)和3岁龄(成年)3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊.以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列(coding sequence,CDS)区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR (quantitative real time PCR,qRT-PCR),Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证.[结果]藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域(靠近N端)和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序.绵羊BOLL在不同哺乳物种间(特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛)具有高度的序列同源性和进化保守性.BOLL蛋白与1 0个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用.随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调.BOLL蛋白主要存在于性成熟后(1岁龄和3岁龄)睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布.qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs (microRNAs,miRNAs) oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调(P＜0.01),而长链非编码RNAs (long noncoding RNAs,lncRNAs) LOC105602204、LOC105603195和LOC105616228以及环状RNAs (circular RNAs,circRNAs) circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调(P＜0.01).oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL3'UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性.[结论]报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用.BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNACirc-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化.