利用原位杂交及原位RT-PCR技术检测梨树组织中苹果茎痘病毒的分布

摘要

[目的]搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑.[方法]以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的eDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证.研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应(IS-RT-PCR)技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化.[结果]梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管柬.蛋白酶K消化时间以20min为宜,要获得良好的扩增效果,RT反应体系中RNaSin的量需大于0.2 U·μ-1,dNTPs大于0.4 mmol·L-1,SupcrScript II在0.1～1.3 U·μ-1～,引物在0.9μmol·L-1.以上.PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃,循环35次,引物浓度应在0.8～1.2 μmol·L-1,LA Taq酶浓度大于0.5 U·100·u-1.[结论]梨树茎尖顶端分生组织0.25mm的区域为无病毒区域.