P-糖蛋白对H2O2诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤的抑制作用

摘要

目的 探讨P-糖蛋白对H2O2诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞氧化损伤的抑制作用.方法 取人RPE细胞株D407细胞,放入体积分数5％CO2培养箱中用含体积分数10％胎牛血清和双抗的DMEM培养基于37℃传代培养.先将细胞按H2O2浓度梯度处理,使用免疫印迹实验和P-糖蛋白荧光性底物罗丹明123蓄积实验确定H2O2对P-糖蛋白表达的最佳诱导浓度.预先使用1μmol·L-1 P-糖蛋白抑制剂Tariquidar处理细胞,通过测量细胞内罗丹明123蓄积量检测P-糖蛋白功能活性.将细胞分成3组:对照组、H2O2模型组(400μmol·L-1)、H2O2+P-糖蛋白抑制剂组(H2O2+Tariquidar),通过检测细胞内ATP水平以及采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率来验证氧化应激下P-糖蛋白功能性表达对细胞氧化损伤的抑制作用.结果 免疫印迹实验结果显示,随着H2O2浓度的增加,P-糖蛋白相对表达量呈剂量依赖性增加并在400μmol·L-1时达到最高值.H2O2在浓度400μmol·L-1时对P-糖蛋白表达和功能均有最明显的诱导作用,该浓度为最佳处理浓度.H2O2+P-糖蛋白抑制剂组中细胞内罗丹明123水平较H2O2模型组增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示Tariquidar能有效抑制P-糖蛋白功能.H2O2模型组ATP水平较对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.001);而H2O2+P-糖蛋白抑制剂组ATP水平则较H2O2模型组更低,差异亦有统计学意义(P<0.05),提示抑制P-糖蛋白功能可进一步加剧氧化应激导致的ATP水平下降.与对照组相比,H2O2模型组细胞凋亡率显著增加,而H2O2+P-糖蛋白抑制剂组细胞凋亡率则较H2O2模型组增加,提示抑制P-糖蛋白功能可加重氧化应激下的细胞凋亡.结论 P-糖蛋白对H2O2诱导的RPE细胞氧化损伤具有一定的抑制作用.