靶向Slug基因腺相关病毒载体的构建及其抑制视网膜母细胞瘤细胞生长的体外研究

摘要

目的 构建并制备携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.方法 首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后回收PCR产物.酶切pSNAV2.0-LacZ-α载体质粒,并与上述产物进行连接.转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测序对其进行鉴定.建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA,大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRNA并对其纯化、鉴定和滴度测定.将体外培养的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)细胞转染rAAV-EGFP-Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体.鸡胚绒毛尿囊膜实验检测血管生成,MTT比色法检测细胞存活率,建立鸡胚绒毛尿囊移植瘤.结果 携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-SIug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确.将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/UL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒rAAV2-EGFP-Slug-siRNA,经检测目的 片段插入成功,滴度为90.21×109 puf.Slug-siRNA有效抑制RB细胞内Slug表达后,肿瘤血管密度明显降低,血管生成被抑制,细胞存活率明显降低.实体瘤血管生成和生长受到抑制.结论 成功制备出高滴度的携带目的 基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.干扰Slug可抑制肿瘤血管生成,抑制RB细胞的生长增殖.