αA晶状体蛋白重组腺病毒载体的构建和鉴定

摘要

目的 构建携带鼠αA晶状体蛋白的腺病毒表达载体,为进一步研究αA晶状体蛋白高表达对损伤条件下神经细胞的保护作用提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的αA晶状体蛋白基因,并克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建携带外源性αA晶状体蛋白编码基因的重组腺病毒载体pAd-CRYAA.脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-CRYAA.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒.以腺病毒感染滴度快速测定试剂盒测定病毒滴度.结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实αA晶状体蛋白基因正确插入腺病毒表达载体,并在人胚肾293细胞中包装出重组腺病毒.收获病毒的滴度为1.143×1012 ifu·L-1.结论 成功构建Ad-CRYAA重组腺病毒表达载体,可作为后续研究中可靠的基因转染工具.