γ-干扰素诱导蛋白10基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

目的：
　　γ-干扰素诱导蛋白10(interferoninducible protein10，IP-10)是CXC类趋化因子，其受体为CXCR3。IP-10在单核巨噬细胞、活化的成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞等多种细胞中表达。IP-10具有多种生物学功能。例如，活化的IP-10可趋化炎症细胞，促进多种细胞释放炎症因子;可以诱导初始的CD4+T细胞向Th1细胞分化，Th1细胞可分泌白介素2和IFN-γ，而IFN-γ又可以促进多种细胞产生IP-10，产生的IP-10通过正反馈作用招募更多的Th1细胞聚集到炎症部位，最终加强Th1型炎症反应等等，表明IP-10与Th1介导的炎症反应密切相关。并且可通过这种炎症反应加强其免疫效应，从而实现抗感染免疫效应。因此，IP-10被认为具有增强免疫效应的免疫佐剂潜能。
　　肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP/PJP），是一种由肺孢子菌(pneumocystis)引起的间质性浆细胞性肺炎。PCP好发于CD4+T细胞数量及功能低下的人群，因此CD4+T细胞的缺乏给预防PCP疫苗免疫效果形成了难以突破的瓶颈。Beck等发现淋巴细胞对于大鼠源肺孢子菌(卡氏肺孢子菌，Pneumocystiscarinii)清除起重要作用，其清除的机制包括CD4+T细胞通过辅助细胞和体液免疫应答发挥作用和CD8+T细胞的直接杀伤作用。McAllister等研究证明CD8+T细胞清除肺孢子菌的主要机制是该类细胞可以较好地表达CXCR3。随后作者提出疑问:机体抵御肺孢子菌感染的过程是否必须有CXCR3介导的信号通路的参与？实验结果表明，CXCR3缺陷但CD4+T细胞水平正常的小鼠，其清除肺孢子菌的能力并未减弱，这说明CXCR3在CD4+T细胞抗肺孢子菌感染过程中并不是必需的分子。而在肺组织内过表达IP-10且缺少CD4+T细胞的小鼠则可加速机体清除肺孢子菌的速率，说明即使机体缺失CD4+T细胞，IP-10也可直接趋化CD8+T细胞到肺部感染区域，发挥清除肺孢子菌的作用，认为IP-10在抗感染及治疗自身免疫性疾病等方面具有潜在的应用前景。
　　以上这些研究结果为预防PCP疫苗的研究提供新思路和新希望。本文拟构建一个IP-10基因的重组腺病毒载体，期望为PCP疫苗研究构建一个加强免疫效应的免疫佐剂，以推进防治PCP疫苗的研究进展。
　　方法：
　　1、大鼠IP-10基因片段的获取与命名
　　(1)大鼠IP-10基因的来源
　　从GenBank中搜索获取大鼠IP-10基因序列（GenBank号BC058444.1），由上海生工生物公司合成并测序验证，命名pUC-IP10。
　　(2) IP-10基因扩增与纯化
　　设计一对引物（引物含起始密码子、终止密码子、酶切位点、保护碱基），以质粒pUC-IP10为模板，用PCR方法扩增IP-10基因，并回收。
　　2、pAd-IP-10重组腺病毒表达载体的构建
　　(1) IP-10基因片段的T载体克隆及鉴定
　　将回收的IP-10基因片段插入到pMD18-T载体，转化至DH5α感受态中，挑单菌落进行菌落PCR鉴定，进而，小试管扩大培养单菌落，质粒小提，利用限制性内切酶BglⅡ及XhoⅠ进行双酶切鉴定，并将剩余质粒送至华大基因公司测序，经测序正确的质粒命名为T-IP10。
　　(2) IP-10基因与pAdTrack-CMV穿梭载体的构建及鉴定
　　分别对质粒T-IP10和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后分别回收所需的的目的片段IP-10及开环的pAdTrack-CMV载体。将载体与目的基因通过T4DNA连接酶连接，并转化DH5α中，涂布于含卡那霉素（100tg/ml）的琼脂平板，挑取单个菌落进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定均正确的质粒命名为pAdTr-IP10。
　　(3) pAd-IP-10重组腺病毒载体的构建
　　利用PmeⅠ酶将pAdTr-IP10线性化，去磷酸化，并纯化后，通过化学转化法转入含骨架质粒pAdEasy-1的Bj5183感受态中，进行细菌内同源重组，涂布于含卡那霉素（100μg/ml）的琼脂平板上，挑选较小的单菌落进行PCR及酶切鉴定。将鉴定正确的质粒命名为pAd-IP10。
　　3、pAd-IP-10重组腺病毒载体的包装
　　将质粒pAd-IP10用PacⅠ酶切线性化并纯化后，通过Attractene TransfectionReagent转染试剂转染HEK293细胞，转染24-48h后经倒置显微镜观察细胞，记录细胞内的绿色荧光蛋白GFP的表达，观察细胞病变(Cytopathic effect，CPE)情况。转染8～10 d后将细胞刮下，将细胞收集在冻存管中，于-80℃和37℃反复冻融5次，12000rpm离心5 min，收集的上清液即为病毒原液。
　　4、pAd-IP-10重组腺病毒的验证
　　取24孔板培养的呈对数生长期的HEK293细胞，弃上清。将重组腺病毒的病毒液原液加入孔中，0.5 ml/孔，轻轻晃动，37℃孵育2h后补加完全培养液0.5 ml/孔，3d后检查细胞是否出现细胞病变效应及绿色荧光，验证重组腺病毒的产生，并收集细胞及上清，利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并反转录成cDNA，经引物IP-10F及IP-10R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
　　结果：
　　1、大鼠IP-10基因获取与鉴定
　　合成并验证了携带大鼠IP-10基因pUC-IP10。用PCR方法扩增出IP-10基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，获得大小约为300bp的产物条带，与预期结果(297bp)一致。
　　2、pAd-IP-10重组腺病毒表达载体的鉴定
　　(1) IP-10基因片段的T载体克隆及鉴定
　　回收的目的基因片段IP-10，与Pmd18-T载体连接，转化后经PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析，在约300bp处出现特异性条带，与预期相符，并将其送至华大基因测序，利用NCBI的BLAST将测序结果与IP-10基因序列比对，一致性为100％。
　　(2) pAdTr-IP10重组腺病毒穿梭载体的鉴定
　　将重组的pAdTr-IP10质粒经PCR扩增鉴定正确后，利用限制性内切酶BglⅡ及XhoⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳，获得两条带，在300bp处的条带为目的基因。
　　(3)重组腺病毒载体的鉴定
　　重组腺病毒载体pAd-IP10经PacⅠ酶切后电泳，可观察到1条大的DNA片段（约31kb）和1条较小的DNA片段(4.5 kb)，确定重组腺病毒载体构建成功。
　　3、pAd-IP10的包装
　　根据Attractene Transfection Reagent转染说明书将质粒pAd-IP10转染HEK293细胞24-48h后，细胞内绿色荧光蛋白GFP表达，出现细胞病变(Cytopathiceffect，CPE)情况。
　　4、重组腺病毒的验证
　　将病毒初液再次感染HEK293细胞后，细胞出现荧光，说明重组的腺病毒具有感染性。并且利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并反转录成cDNA，进行PCR扩增后，电泳结果显示pAd-IP10重组腺病毒感染的293细胞，PCR检测显示有1条约300 bp条带，而pAd-Track感染的293细胞，及正常细胞均无此特异条带，则表明该条带系pAd-IP10重组腺病毒感染293细胞后产生的IP-10，重组腺病毒pAd-IP10在293细胞中能有效转录。
　　结论：
　　1、成功构建了γ-干扰素诱导蛋白10基因的重组腺病毒载体。
　　2、重组腺病毒载体pAd-IP10在HEK293细胞中包装出病毒并得到验证病毒具有感染性，能在真核细胞中进行有效转录。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 γ-干扰素诱导蛋白10基因在感染性肺疾病中的研究进展

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