靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)RNAi载体的构建及活性评价

摘要

RNA干涉是由与特定基因同源互补的双链RNA,在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程.为研究内源性的siRNA对靶基因的抑制效果,用pPUR/U6载体构建用于细胞内转录靶向hTERT基因的短发夹状siRNA表达质粒,并评价其对hTERT基因的抑制效果.将hTERT cDNA 3 565～3 583一段19 bp的DNA序列及其反向重复序列,用9 bp的连接序列连接后再接上5个T碱基,将此段DNA序列克隆至pPUR/U6载体U6启动子的下游,形成能在体内合成hTERT特异性短发夹状RNA的重组质粒载体pPUR/U6/hTERT.将pPUR/U6/hTERT与对照质粒pPUR/U6分别转染HepG2细胞.采用嘌呤霉素筛选和富集转染具有抗性的细胞.收集存活的细胞接种12孔板、提取RNA和蛋白质.以细胞计数法测定细胞的生长速度,RT-PCR和蛋白质印迹分析hTERT基因的表达,端粒重复放大测定法检测端粒酶活性,蛋白质印迹检测p53蛋白水平.与转染对照质粒pPUR/U6的细胞相比,转染pPUR/U6/hTERT的细胞其hTERT基因表达水平显著下降,端粒酶活性降低,细胞生长速度变慢,p53蛋白表达明显升高.以上结果表明,以DNA质粒为载体产生的内源性短发夹状siRNA能高效抑制hTERT基因的表达,有望成为基因功能研究的有力工具.