靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对LoVo细胞侵袭和增殖能力的抑制作用

摘要

通过构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)的小片段发夹状RNA(shRNA)干扰表达质粒,研究了shRNA表达质粒沉默GnT-V基因后对LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响.设计了靶向GnT-V基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染人结肠癌LoVo细胞,通过G418筛选建立稳定低表达GnT-V基因的细胞株.分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测shRNA对GnT-V基因mRNA及蛋白质表达的影响.并通过CCK-8增殖实验、异质黏附实验、划痕愈合实验、趋化运动实验、细胞侵袭实验评价pGPU6/GFP/Neo GnT-VshRNA对人结肠癌LoVo细胞增殖、黏附以及迁移、侵袭能力的影响.实验成功地构建了GnT-V shRNA表达质粒,并且该质粒明显下调GnT-V的表达,LoVo GnT-V/1564和LoVo GnT-V/2224的mRNA水平的抑制率分别为82%和71.5%,蛋白质水平的抑制率分别为68%和56%.选择干扰效率较高的LoVo GnT-V/1564进行进一步实验.CCK-8增殖实验显示,与阴性对照组相比,LoVo GnT-V/1564的增殖受剑明显抑制(p＜0.001),尤以72 h为著;下调GnT-V表达町增强LoVo细胞的黏附能力(t=-3.357,P＜0.01),而显著抑制LoVo细胞的趋化运动能力(t=44.051,P＜0.001);划痕实验结果也显示抑制GnT-V表达延长LoVo细胞的愈介时间;用Matrigel胶介导的细胞侵袭实验结果显示,LoVoGnT-V/1564和LoVo GriT-V/NC 的穿膜细胞数分别为(5.10±1.25)个和(39.55±2.16)个,GriT-V/1564组较阴性对照组明显减少(t=61.626,P＜0.001).结果表明,靶向CnT-V的shRNA真核表达质粒可以显著降低GnT-V的表达,从而抑制LoVo细胞的增殖、迁移和侵袭能力,因此,该GnT-V的siRNA序列可能成为治疗结直肠癌的有效靶点.