香芹酚通过增强PTEN诱导激酶1/Parkin介导的自噬而减轻心肌缺血再灌注损伤的动物及细胞实验

摘要

背景 在心血管疾病中,PTEN诱导激酶1(PINK1)/Parkin介导的自噬通过有效地清除受损的线粒体和过量的活性氧(ROS)来维持细胞内线粒体的动态平衡.香芹酚具有减少心肌细胞中ROS生成和降低线粒体损伤的作用.然而,目前尚不清楚香芹酚对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中自噬的影响.目的 通过动物及细胞实验探讨香芹酚对MIRI的治疗作用及其机制.方法 本研究时间为2020年5月至2021年5月.动物实验:将成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为Sham组(A组)、MIRI组(B组)、MIRI+20 mg/kg香芹酚组(C组)和MIRI+60 mg/kg香芹酚组(D组),每组12只.B、C、D组大鼠建立MIRI模型,A组大鼠接受相同的手术,但不结扎冠状动脉左前降支;术前15 min,C组和D组大鼠腹腔注射相应剂量的香芹酚,A组和B组大鼠给予等体积的0.9％氯化钠溶液.检测A、B、C、D组大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,心肌梗死面积,心肌病变情况,心肌组织中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ.细胞实验:将H9C2细胞分为对照组(E组)、缺氧/复氧(H/R)组(F组,进行H/R处理)、H/R+香芹酚组(G组,用100μmol/L香芹酚预处理6 h后进行H/R处理)、H/R+香芹酚+阴性对照小干扰RNA(NC-siRNA)组(H组,转染NC-siRNA后用100μmol/L香芹酚预处理6 h,然后进行H/R处理)和H/R+香芹酚+靶向PINK1的小干扰RNA(PINK1-siRNA)组(I组,转染PINK1-siRNA后用100μmol/L香芹酚预处理6 h,然后进行H/R处理).检测E、F、G、H、I组细胞活力、细胞凋亡率,H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ.结果 动物实验:B、C、D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平高于A组(P<0.05);C、D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于B组(P<0.05);D组大鼠血清cTnI、CK-MB、AST、LDH水平低于C组(P<0.05).A组大鼠心肌梗死面积为0.C、D组大鼠心肌梗死面积小于B组(P<0.05);D组大鼠心肌梗死面积小于C组(P<0.05).HE染色结果显示,A组大鼠心肌细胞排列整齐,细胞核明显,无炎性细胞浸润;B组大鼠心肌组织广泛坏死,心肌纤维排列紊乱,大量炎性细胞浸润;C、D组大鼠心肌细胞排列较整齐,细胞坏死程度和范围明显减轻.Masson三色染色结果显示,A组大鼠心肌组织以心肌细胞为主,没有明显的胶原成分;B组大鼠心肌组织心肌纤维化明显,仅有少量心肌细胞存在;C、D组大鼠心肌组织的胶原纤维含量明显减少.定量分析结果显示,B、C、D组大鼠心肌纤维化百分比高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌纤维化百分比低于B组(P<0.05);D组大鼠心肌纤维化百分比低于C组(P<0.05).TUNEL染色结果显示,B、C、D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率低于B组(P<0.05);D组大鼠心肌组织TUNEL阳性率低于C组(P<0.05).B、C、D组大鼠心肌组织中PINK1、Beclin1蛋白表达水平低于A组,B、C组大鼠心肌组织中Parkin蛋白表达水平低于A组,B组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于A组,C、D组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于A组(P<0.05);C、D组大鼠心肌组织中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于B组(P<0.05);D组大鼠心肌组织中Parkin、Beclin1蛋白表达水平高于C组,(P<0.05).细胞实验:F、G、H、I组细胞活力小于E组(P<0.05);G、H组细胞活力大于F组(P<0.05);I组细胞活力小于G、H组(P<0.05).F、G、H、I组细胞凋亡率高于E组(P<0.05);G、H、I组细胞凋亡率低于F组(P<0.05);I组细胞凋亡率高于G、H组(P<0.05).F组H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E组(P<0.05);G、H组H9C2细胞中PINK1、Beclin1蛋白表达水平低于E组、高于F组,Parkin蛋白表达水平高于F组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于E、F组(P<0.05);I组H9C2细胞中PINK1、Parkin、Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ低于E、G、H组,Beclin1蛋白表达水平高于F组(P<0.05).结论 动物及细胞实验均表明,香芹酚通过激活PINK1/Parkin通路增强自噬,从而减轻MIRI.