5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2基因去甲基化的转录调节作用

摘要

目的探讨DNA 5′CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2抑癌基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点.方法用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)作用结肠癌细胞株72 h后,甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR, MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-time PCR)、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western blot)检测用药前后RKO细胞株生长倍增时间以及对p16/CDKN2 mRNA及蛋白表达的影响.结果 (1)未经5-Aza-deoxycytidine作用的对照组RKO细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经5-Aza-CdR作用的RKO结肠癌细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶;(2)与对照组相比,3组不同浓度5-Aza-2′-deoxycytidine 均能明显抑制肿瘤细胞生长,倍增时间分别增加了1.49、1.64、1.87倍;(3)经5-Aza-2′-deoxycytidine 作用后,p16/CDKN2基因mRNA表达分别增加了4.89、16.91、19.97倍,而DNA甲基转移酶mRNA表达显著降低;(4)免疫组化染色和蛋白印迹均显示,经处理后的肿瘤细胞p16/CDKN2蛋白表达呈明显增强.结论 DNA异常甲基化与RKO结肠癌细胞有关;特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致p16/CDKN2基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长.