金针菇G蛋白偶联受体基因的CRISPR/Cas9基因组编辑载体构建及转化研究

摘要

通过氨基酸同源比对(Blast P)以及金针菇冷诱导前后菌丝阶段和原基阶段的转录组数据分析,获得了金针菇中的两个假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2.对获得的金针菇假定G蛋白偶联受体基因Fvgpcr1、Fvgpcr2构建了基因组编辑(CRISPR/Cas9)的pCAM BIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr1-sgRNA1/sgRNA2、pCAMBIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr2-sgRNA1/sgRNA2等4个表达载体.通过农杆菌介导(ATMT)将表达载体pCAM BIA0390-h ph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA转化金针菇菌丝体,采用潮霉素和头孢毒素低浓度初筛和高浓度复筛,经两段筛选获得金针菇拟转化子.经对拟转化子进行PCR鉴定、RT-qPCR 检测和Western杂交验证,结果显示表达载体pCAM BIA0390-hph-Fvcas9-Fvgpcr-sgRNA成功整合进金针菇基因组中,FvCas9蛋白正常表达,但未得到Fvgpcr基因敲除突变体.本研究利用农杆菌介导转化法在金针菇中构建了CRISPR/Cas9敲除体系,对后续目标基因的敲除有着重要意义.