屎肠球菌132胆盐水解酶基因的克隆表达与酶学特性

摘要

该研究旨在探究降胆固醇潜在菌株屎肠球菌132胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)的活性,通过PCR技术克隆目的基因并在大肠杆菌BL21中表达,同时探讨其酶学特性。利用茚三酮法对其菌体破碎液BSH活性进行测定,比酶活达0.55 U/mg。通过克隆其目的基因,连接pET-28a(+)的表达载体并进行异源表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验显示,该酶分子量约37 ku。当底物为甘氨胆酸钠(glycocholic acid,GCA)、pH 5.50时,BSH酶活达4.93 U/mg。酶学特性结果表明,GCA为底物、pH 5.50、温度为30℃时达最适条件,BSH水解能力最强,酶活达6.59 U/mg,温度在4-30℃时,pH为5-7有较好的热稳定和pH稳定性。不同离子对酶活的影响实验表明Na^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)均对酶活有激活作用;Mn^(2+)、Fe^(2+)对酶活影响不大,但Ni^(2+)、Al^(3+)、Li^(2+)、Co^(2+)、Zn^(2+)均对酶活有强抑制作用,比酶活降到10%以下,几乎丧失活性。通过酶反应动力学得出该酶的V_(max)为6.44μmol/(min·mg),K_(m)值为3.16 mmol/L。因此,通过bsh基因克隆并异源表达,提高了屎肠球菌132BSH活性,并且BSH水解各类胆盐能力较强,为降胆固醇功能食品的开发与应用奠定基础。