利用双荧光素酶报告系统鉴定小鼠Vamp8基因启动子核心区域及转录调控元件

摘要

目的 通过构建小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区荧光素酶报告质粒,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区域及转录调控元件.方法 通过检索美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因数据库和真核生物启动子数据库(EPD),获取包含可能的启动子及转录调节区域的小鼠Vamp8基因序列(-1033 ～ +2330 bp).以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)基因组DNA为模板,PCR扩增钓取该序列,构建小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒,通过荧光素酶活性检测,验证其启动子活性.随后,通过截短突变及生物信息学分析,寻找小鼠Vamp8基因启动子的核心区和主要转录调控区,以及可能的转录因子.结果 成功克隆了小鼠Vamp8基因的转录调控区,构建了5个系列截短的小鼠Vamp8基因启动子荧光素酶报告质粒和3个小鼠Vamp8基因转录调节区荧光素酶报告质粒,测序均正确.通过荧光素酶活性检测、生物信息学分析及验证,发现小鼠Vamp8基因-198 ～ +85 bp区域的启动子活性最高,推测其为小鼠Vamp8基因启动子核心区域;而-1033 ～-199 bp和-198～-37 bp区域分别存在Vamp8基因转录负调控和正调控元件.转录因子CEBPB可促进Vamp8基因转录,其主要结合位点位于-198～-1 bp,与生物信息学预测相符.结论 成功构建了小鼠Vamp8基因启动子及转录调节区双荧光素酶报告系统,发现小鼠Vamp8基因-198～+85 bp区域为该基因启动子核心区域,-1033 ～-199 bp和-198～-37 bp区域参与其转录调控.转录因子CEBPB可能通过与小鼠Vamp8基因-198～-1 bp区域的DNA序列结合,促进其转录.上述研究为阐明Vamp8基因转录调控的分子机制奠定了基础.