E6AP蛋白结构域突变真核表达载体的构建及其生物学功能检测

摘要

目的构建E6AP蛋白结构域突变真核表达载体,并瞬时转染肿瘤细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法以本实验室保存带有myc标签的E6AP质粒为模板,采用PCR技术扩增出E6AP（1～494）结构域和E6AP（495～852）结构域（即E6AP的HECT结构域）编码区（CDS）序列,将其插入到p XJ-40-myc载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹鉴定其表达及功能;转染人乳腺癌细胞ZR75-1和人胃癌细胞BGC-823,通过CCK-8法测定细胞生长曲线。结果从E6AP蛋白全长CDS中扩增得到约1479、1071 bp的DNA结构域片段,并成功克隆至p XJ-40-myc载体上,且测序与目的序列完全一致;转染人胚肾293T细胞后,目的蛋白在细胞内成功表达,并且E6AP（495～852）结构域可明显抑制P53蛋白水平,而E6AP（1～494）结构域无抑制作用;细胞生长曲线结果显示,转染E6AP（495～852）结构域突变质粒的乳腺癌、胃癌细胞较空载体细胞生长差异具有统计学意义,而E6AP（1～494）对细胞生长无明显变化。结论成功构建了myc-E6AP（1～494）、（495～852）结构域突变真核表达载体,为进一步研究E6AP蛋白在相关肿瘤发生、发展中的作用奠定一定的基础。