G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

摘要

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBV CP变异对下游基因转录活性的影响.方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBV CP片段,克隆至pGEM-T Easy载体.挑选含有CP相关变异位点的质粒,经Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测.结果 患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05).细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍.结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBV CP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用.