基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建

摘要

目的:制备基于Xcm Ⅰ酶切的高效TA克隆载体,并检测其克隆PCR产物的效果.方法:设计一对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点,从而在该多克隆位点中引入2个Xcm Ⅰ酶切位点,用Xcm Ⅰ酶切后即获得含有3'突出T碱基的T载体;为了提高该T载体的克隆效率,优化了2个Xcm Ⅰ酶切位点之间的碱基数目,排除了载体自连产生白色克隆的可能性,使假阳性大大减少;此外,为了便于完全酶切与未完全酶切载体的分离,在2个Xcm Ⅰ之间插入了一段无关DNA片段.结果:改进得到的T载体可以有效克隆PCR产物,其阳性克隆率可达95%.结论:构建了基于XcmⅠ酶切的TA克隆载体,经过改进的T载体具有很高的克隆效率.