人过氧化氢酶基因重组腺病毒的构建及其酶活性的测定

摘要

目的:构建含人过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的重组腺病毒载体,为基因治疗提供一种新的方法。方法:从人血中分离白细胞,提取总RNA,利用RT-PCR法获得人CAT的全长cDNA,克隆到pcDNA3.1+中,构建pcDNA3.1+-CAT载体,酶切和基因测序鉴定阳性克隆;利用酶切法把CAT基因克隆至入门载体pENTR1A中,构建pENTR1A-CAT载体;利用LR反应,体外重组pENTR1A-CAT和pAd/CMV/V5-DEST,得重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST-CAT。经测序鉴定,并用Pac I线性化pAd/CMV/V5-DEST-CAT后,与脂质体2 000共转染293A细胞,重组病毒颗粒的包装、扩增和滴度测定。利用免疫印迹和240 nm紫外光吸收法测定重组病毒中CAT蛋白的表达量和CAT的活性。结果:Ad-CAT、(A组)Ad-LacZ(B组)及PBS(C组)感染293A细胞24h,其细胞蛋白提取液在1至4 m in反应中CAT活性的变化经单因素方差分析,三组间差异有统计学意义(F=5.96,P0.05)。结论:本研究成功构建了含人CAT基因的Ad/CMV/V5-DEST-CAT载体,并在293A细胞中包装出高表达及高活性重组腺病毒,为进一步研究人CAT基因在基因治疗中的作用奠定了基础。