PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在转录后水平调控ICAM-1的表达

摘要

目的 探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)/糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)信号通路调控脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及其机制.方法 ①LPS(10 mg/L)刺激HUVEC0、6、12、24h或者0、4、8、12 h或者0、30、60、120 min后,Western blot检测ICAM-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β和p-GSK-3β的表达,实时荧光定量PCR (qPCR)检测ICAM-1 mRNA的表达.②将PI3K、AKT和GSK-3β的siRNA分别转染HUVEC,转染浓度梯度为40、80和100nmol/L,对照组转染control siRNA,Western blot检测PI3K、AKT和GSK-3β总蛋白的表达.③将PI3K、AKT和GSK-3β的siRNA分别转染HUVEC,对照组转染control siRNA,LPS刺激细胞30 min、1h、8h和12 h,Western blot检测p-AKT、p-GSK-3β和ICAM-1的表达,qPCR检测ICAM-1 mRNA的表达.④转染方法同上,LPS刺激HUVEC 8 h后加入放线菌素D(ActD)5 mg/L抑制转录,于0、1、2、3和4h收集细胞,qPCR检测ICAM-1mRNA的表达并计算mRNA的半衰期.结果 ①LPS刺激HUVEC后ICAM-1的表达12 h达高峰,与其他时间点有显著差异(P＜0.05或P＜0.01);LPS刺激HUVEC后ICAM-1 mRNA的表达8h达高峰,与其他时间点有显著差异(P ＜0.05或P＜0.01);LPS刺激HUVEC后PI3K、AKT和GSK-3β蛋白的磷酸化水平分别在刺激30min、1h和1h后达高峰.②PI3K、AKT和GSK-3β转染组的最适转染浓度为100 nmol/L.③PI3K转染组的p-AKT和p-GSK-3β表达显著下降(P＜0.01),AKT转染组p-GSK-3β表达显著下降(P ＜0.01);PI3K和AKT转染组的ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著升高(P＜0.05或P＜0.01),相反GSK-3β转染组ICAM-1的蛋白和mRNA表达均显著下降(P＜0.01).④PI3K、AKT的沉默表达显著延长ICAM-1的mRNA半衰期(P＜0.01),相反GSK-3β的沉默表达显著缩短ICAM-1的mRNA半衰期(P＜0.01).结论 LPS通过激活PI3K/AKT/GSK-3β信号通路负向调控HUVEC表达ICAM-1.PI3K、AKT和GSK-3β在转录后水平调控ICAM-1mRNA的稳定性.