GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达

摘要

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达.方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pssHGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pssHGCMV-GFP.以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化.用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度.采用氯化钙法体外转染培养的NIH 3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达.结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒-VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL.重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NIH 3T3细胞后48 h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强.结论 VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗.