MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用

摘要

目的：通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3（MAGE-A3）蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测.方法：将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a（＋）,构建pET21a（＋）/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Westernblot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性.结果：成功构建重组质粒pET21a（＋）/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白.SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48kDa,与预期蛋白大小-致,并以His单抗进行Westernblot鉴定,出现了特异性的单-条带.MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Westernblot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单-条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375（黑色素瘤细胞株）和SGC-7901细胞（胃癌细胞株）的胞浆内出现荧光团块.表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白.结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆IgG抗体效价可达1：40000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白.结论：通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原.