粪便中日本血吸虫虫卵DNA的提取及PCR检测方法的优化

摘要

目的 建立一套系统、完整的粪便日本血吸虫虫卵DNA提取法及PCR优化体系.方法 利用蛋白酶K和苯酚法从感染日本血吸虫尾蚴的家兔粪便中提取DNA,根据日本血吸虫基因(AF00369)设计特异性引物,以粪便中提取的DNA为模板,采用PCR方法 扩增目的 基因片段,对PCR方法 的各种反应条件进行优化并采用有限稀释法推测PCR检测法可检测到的最低虫卵数.结果 以感染家兔的粪便中提取的DNA为模板,用PCR方法 可扩增到分子量大小约为400bp的特异性条带,测序结果 经BLAST工具进行分析,与日本血吸虫基因(AF00369)比对的同源性为96%;25μl PCR反应体系的最优化反应条件:MgCl2 1.5μl;dNTP 0.5μl;引物 1.Oμl;DNA模板5.0μl;Taq DNA聚合酶0.5μl.扩增程序为:94℃预变性5min、94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s,30个循环、72℃延伸7min、4℃保存.PCR检测法可检测到的最低虫卵数为0.015个.结论 成功建立感染家兔粪便中虫卵DNA的提取方法 及PCK血吸虫基因片段检测方法 ,同时对PCR反应条件进行优化,为从分子角度检测日本血吸虫虫卵DNA提供科学的实验依据.