细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用

摘要

目的探讨用细菌内同源重组法制备含TK自杀基因腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用。方法将TK基因自载体中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成质粒pAdT rack-GFP-TK,将其PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,观察其对肝癌细胞的感染效率和目的基因表达情况及肝癌细胞SMMC-7721感染含TK自杀基因腺病毒后加入丙氧鸟苷(GCV)的生存率和旁观者效应的体外观察。结果纯化所得腺病毒滴度约为2×1012efu/mL,当病毒感染复数(MOI)=100时,腺病毒感染SMMC-7721细胞的效率>90%,实验证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达,SMMC-7721/Ad-TK细胞对GCV高度敏感,半杀伤浓度(IC50)仅为0.2μmol/L,HSV-TK/GCV系统在SMMC-7721细胞中存在明显的旁杀伤效应。结论细菌内同源重组法制备重组腺病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外整合到肝癌细胞SMMC-7721中,并能高效表达,使其对GCV高度敏感。旁观者效应极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能。