miR-26a-5p对H_(2)O_(2)诱导的EA.hy926血管内皮细胞损伤的影响

摘要

目的探讨miR-26a-5p对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的EA.hy926内皮细胞焦亡和血栓因子(TF)的影响及其机制。方法MTT法检测不同浓度H_(2)O_(2)(0,100,300,400,450,500,700μmol/L)刺激EA.hy926内皮细胞后的存活率。为了研究H_(2)O_(2)对EA.hy926内皮细胞的影响,分为control组(0μmol/L H_(2)O_(2))和450μmol/L H_(2)O_(2)组;为了研究miR-26a-5p对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的EA.hy926内皮细胞损伤的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系,分为miR-26a-5p mimic+H_(2)O_(2)组,mimic NC+H_(2)O_(2)组,miR-26a-5p inhibitor+H_(2)O_(2)组,inhibitor NC+H_(2)O_(2)组。使用流式细胞术检测活性氧水平(ROS),Western blot检测焦亡关键物Caspase-1蛋白水平和血栓指标TF以及PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测焦亡指标Caspase-1、IL-18、IL-1β和血栓指标TF的mRNA水平。为了检测miR-26a-5p转染效率,分别转染带Fam荧光的mimic NC,miR-26a-5p mimic,inhibitor NC,miR-26a-5p inhibitor后,荧光显微镜下观察Fam荧光分布情况,RT-qPCR检测转染后miR-26a-5p mRNA表达情况。结果MTT结果显示随着H_(2)O_(2)浓度升高,EA.hy926内皮细胞存活率呈下降趋势(P<0.05)。与control组相比,450μmol/L H_(2)O_(2)组ROS水平、Caspase-1、TF蛋白表达增加(P<0.05),Caspase-1、TF、IL-18、IL-1β的mRNA表达均增加(P<0.05)。荧光显微镜下,Fam荧光占视野的60%~80%。与转染mimic NC相比,转染miR-26a-5p mimic后,miR-26a-5p mRNA相对表达量增加(P<0.05);与转染inhibitor NC相比,转染miR-26a-5p inhibitor后,miR-26a-5p mRNA相对表达量减少(P<0.001)。与mimic NC+H_(2)O_(2)组相比,miR-26a-5p mimic+H_(2)O_(2)组ROS表达下降(P<0.05),TF、Caspase-1蛋白表达量降低(P<0.01),TF、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表达减少(P<0.001),而p-PI3K、p-Akt蛋白表达量增加(P<0.05);与inhibitor NC+H_(2)O_(2)组相比,miR-26a-5p inhibitor+H_(2)O_(2)组ROS表达升高(P<0.05),TF、Caspase-1蛋白表达增加(P<0.05),TF、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表达增加(P<0.05),但p-PI3K、p-Akt蛋白表达量降低(P<0.05)。结论H_(2)O_(2)刺激EA.hy926内皮细胞发生氧化损伤,促进细胞焦亡和TF表达水平增加;而miR-26a-5p能改善H_(2)O_(2)诱导的EA.hy926细胞焦亡,降低TF表达水平,其机制可能与其激活PI3K/Akt通路有关。