家族性高血钾型高血压Cullin3致病突变体neddylation异常的分子机制研究

摘要

目的 探讨Cullin3(CUL3)致病突变体Cullin3 △9(缺失9号外显子,CUL3 △9)是否由于与COP9信号体(CSN)结合减弱而导致其类泛素化修饰异常.方法 使用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞株,采用脂质体转染技术,将CSN5 siRNA与FLAG-CUL3质粒或FLAG-CUL3 △9质粒共转染HEK293细胞,Western blotting观察CUL3和CUL3 △9类泛素化修饰程度的变化;转染FLAG-CUL3或FLAG-CUL3 △9质粒后,以金属蛋白酶抑制剂1,10-菲咯啉进行预孵育,Western blotting观察CUL3和CUL3 △9类泛素化修饰程度的变化;在转染FLAG-CUL3质粒和FLAG-CUL3 △9质粒后,以FLAG抗体与Dynabeads Protein G磁珠行免疫共沉淀,Western blotting观察CUL3或CUL3 △9与CSN5的结合状态.结果 转染CSN5 siRNA后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3 △9的类泛素化修饰程度无明显变化;以1,10-菲罗啉预孵育后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3 △9的类泛素化修饰程度无明显变化;免疫共沉淀结果显示CUL3与CSN5结合,而CUL3 △9与CSN5结合减弱.结论 CUL3 △9与CSN结合减弱导致类泛素化修饰异常.