目的探讨通过泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡通路对体外培养玻璃化冷冻未成熟卵母细胞(VIOs)的DNA完整性和发育潜能的影响。方法取200只雌性ICR小鼠未成熟卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。实验Ⅰ:将未成熟COCs分为阴性对照组(FOs组,n=31,新鲜COCs)、阳性对照组(HPOs组,n=32,过氧化氢暴露COCs约3 h)、2 h VIOs组(n=31,玻璃化复苏COCs 2 h)、18 h VIOs组(n=32,玻璃化复苏COCs 18 h),探讨玻璃化冷冻对未成熟卵母细胞凋亡通路的影响。实验Ⅱ:将未成熟COCs分为VIOs(-/-)组(n=36,未加入Z-VAD-FMK)、VIOs(+/-)组(n=37,仅在玻璃化冷冻复苏培养基中添加Z-VAD-FMK)和VIOs(+/+)组(n=34,在玻璃化冷冻复苏培养基和复苏后培养基中均添加Z-VAD-FMK),复苏后孵育18 h进行染色,探讨Z-VAD-FMK对凋亡标志物[未成熟卵母细胞DNA片段化(TUNEL阳性卵母细胞百分比)、Caspase活性]的影响。实验Ⅲ:将未成熟COCs分为FOs组(n=130)、VIOs(-/-)组(n=129)和VIOs(+/+)组(n=128),分组操作同上,分析Z-VAD-FMK对VIOs体外发育潜能的影响。结果实验Ⅰ结果显示,HPOs组、18 h VIOs组未成熟卵母细胞DNA片段化比例高于FOs组(P0.05)。实验Ⅱ结果显示,与VIOs(-/-)组相比,VIOs(+/-)组未成熟卵母细胞DNA片段化比例较低(P=0.007);VIOs(+/+)组未成熟卵母细胞DNA片段化比例和Caspase活性低于VIOs(+/-)组和VIOs(-/-)组(P0.05),但VIOs(+/+)组和VIOs(-/-)组闭锁率高于FOs组(P<0.001);VIOs(-/-)组和VIOs(+/+)组5~8细胞、9~16细胞胚胎发育率均低于FOs组(P<0.001);在胚胎发育后期,VIOs(-/-)组和VIOs(+/+)组均无囊胚形成,与FOs组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论玻璃化冷冻提高了VIOs的凋亡标志物水平,而Z-VAD-FMK能够抑制DNA损伤和Caspase活性,但其可能并不是胚胎发育的决定因素。
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