促排卵周期未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后体外成熟培养的实验观察

摘要

背景与目的：
　　在人类辅助生殖技术中，获取足够数目的成熟卵母细胞是患者完成受精、胚胎移植以及获得临床妊娠的关键因素。在常规体外受精/卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo
　　transfer, IVF/ICSI-ET）周期中，通过控制性促排卵（controlled ovarian stimulation, COS）治疗可获得多枚卵母细胞，其中15％为未成熟卵母细胞，使可利用卵子数大大降低，进而影响患者的最终妊娠结局。人类未成熟卵母细胞体外成熟培养（in vitro maturation, IVM）正逐渐成为解决这些问题的有效途径，但据文献报道目前IVM的临床妊娠率仅为20%-35%，作为一种常规技术推广应用尚有不少问题亟需解决。
　　近年来，低温保存技术发展迅速，胚胎及精子冷冻已经得到较广泛的应用，但卵母细胞冷冻尚未常规开展起来。玻璃化冷冻作为新兴技术，可较好地保留
　　细胞内的超微结构，维持细胞内外离子、分子的分布平衡，有效解决了程序化冷冻易出现去玻璃化和再结晶导致细胞损伤的难题，近年来已被广泛应用于辅助生殖领域。本研究将IVM与玻璃化冷冻技术相结合，探索未成熟卵母细胞冷冻的最佳时期，并通过在IVM培养基内添加抗氧化剂褪黑素（melatonin, MT）的方法优化未成熟卵母细胞体外培养体系。
　　材料和方法：
　　实验第一阶段收集符合纳入条件的ICSI周期患者未成熟的卵母细胞，依其成熟度分为第一次减数分裂前期双线（germinal vesicle, GV）期和第一次减数分裂中期（metaphaseⅠ, MⅠ）期，行玻璃化冷冻后同一时间解冻，常规IVM培养，ICSI方式受精，比较不同时期未成熟卵母细胞存活、成熟、受精情况及早期胚胎质量。
　　实验第二阶段同前收集患者促排卵周期中的未成熟卵子，玻璃化冷冻后复苏并随机分组，对不同组IVM培养基中分别添加不同浓度的外源性褪黑素（浓度梯度设置为10-2nmol/l、1nmol/l、102nmol/l、104nmol/l、106nmol/l、108nmol/l），体外成熟培养后行ICSI受精，比较不同浓度组间存活率、成熟率、受精率及早期胚胎发育情况。
　　统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据统计分析，其中计量资料以?x±s(均数±标准差)表示，用χ2检验及Fisher’s精确概率检验进行各组间发生率的比较，当检验标准为α=0.05，P<0.05时认为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、不同时期未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后复苏及体外成熟比较
　　研究第一部分共纳入符合条件的233名不孕患者502枚未成熟卵母细胞，其中MⅠ期卵母细胞323枚，GV期卵母细胞179枚。GV期组冷冻后复苏存活率显著高于MⅠ期（83.24%vs.75.54%, P＝0.045），但两组间体外成熟率无显著差异（73.82%vs.80.74%, P＞0.05）。
　　2、不同时期未成熟卵母细胞玻璃化冷冻后IVM发育潜能比较
　　MⅠ期组可用胚胎率显著高于GV期组（76.77%vs.61.11%, P＝0.041）；MⅠ组受精率、优质胚胎率高于GV期组，但无显著性差异（60.51%vs.56.88%, P＞0.05;39.39%vs.31.48%, P＞0.05）；MⅠ组卵裂率、囊胚形成率低于GV期组，但无显著性差异（83.90%vs.87.10%, P＞0.05;7.07%vs.9.26%, P＞0.05）。
　　3、添加不同浓度褪黑素卵母细胞成熟率比较
　　10-2nmol/l、1nmol/l、102nmol/l、104nmol/l、106nmol/l、108nmol/l不同浓度褪黑素添加组共纳入符合条件的602名ICSI周期患者，每组86名。7组患者间各组间获取卵子数、患者年龄、BMI指数、基础FSH、Gn总量、卵子成熟率的差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　1nmol/l褪黑素添加组GV期、MⅠ期未成熟卵母细胞成熟率显著高于空白对照组（78.00%vs.71.43%, P＝0.040;84.42%vs.74.39%, P＝0.049），但108nmol/l褪黑素浓度添加组GV期、MⅠ期卵母细胞成熟率、56.94%显著低于空白对照组（51.11%vs.71.43%, P＝0.043;56.94%vs.74.39%, P＝0.022）。10-2nmol/l、102nmol/l、104nmol/l、106nmol/l各不同浓度褪黑素添加组卵母细胞成熟率与空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　4、添加不同浓度褪黑素卵母细胞成熟后早期胚胎发育比较
　　10-2nmol/l、1nmol/l、102nmol/l、104nmol/l、106nmol/l、108nmol/l不同浓度褪黑素添加组与对照组相比，受精率、卵裂率、囊胚形成率间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1、GV期是最佳的未成熟卵母细胞冷冻时机，但MⅠ期卵母细胞复苏后早期胚胎发育潜能优于GV期。
　　2、适宜浓度的褪黑素添加可以促进人类未成熟卵母细胞体外成熟培养，MT的最佳浓度为1nmol/l，但当外源性褪黑素添加浓度过高时，则可能产生反作用。
　　3、IVM培养液内添加褪黑素并未改善卵母细胞受精及早期胚胎发育情况。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略词表

引言

实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 方法

结果

2.1不同时期未成熟卵母细胞冷冻后复苏、成熟情况比较

2.2不同时期未成熟卵母细胞冷冻后发育潜能比较

2.3 IVM不同浓度褪黑素添加组患者一般情况

2.4 不同浓度褪黑素添加组卵母细胞成熟率比较

2.5 添加不同浓度褪黑素卵母细胞成熟后早期胚胎发育比较

讨论

3.1 GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果优于MⅠ期卵母细胞

3.2 MⅠ期卵母细胞玻璃化冷冻后发育潜能优于GV期卵母细胞

3.3添加适宜浓度褪黑素提高冷冻后未成熟卵母细胞体外成熟率

3.4外源性褪黑素添加未改善冷冻后的未成熟卵母细胞发育潜能

3.5 玻璃化冷冻未成熟卵子联合IVM可行性分析

结论

参考文献

综述一: 未成熟卵母细胞冷冻保存的研究进展

综述二: 人未成熟卵母细胞培养体系研究进展

个人简历

攻读硕士期间发表学术论文情况

致谢