基于μ阿片受体羧基端^(375)STANT^(379)磷酸化位点的多肽干预对吗啡介导的受体下游信号通路的影响

摘要

目的探讨基于μ阿片受体(MOR)羧基端^(375)STANT^(379)磷酸化位点的多肽TAT-Q368-T379干预,对μ阿片受体下游信号通路的影响。方法将HA-MOR质粒与pGloSensorTM-22F质粒共转染的HEK-293细胞分为空白组(A组)、DAMGO组(B组)、吗啡组(C组)、0.5×10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(D组)、10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(E组)、2×10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(F组),通过GloSensor cAMP生物传感器测定各组细胞中的cAMP含量。将MOR-C端标记Nanoluc的质粒以及β-arrestin2-N端标记EYFP的质粒共转染完成的HEK-293细胞分为空白组(G组)、DAMGO组(H组)、吗啡组(I组)、10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(J组)、3×10^(-5)mol/L Cmpd101与吗啡联用组(K组),通过蛋白质相互作用分析法测定各组细胞MOR激动后对β-arrestin2的募集效应。将HA-MOR质粒转染完成的HEK-293细胞分为空白组(L组)、吗啡组(M组)、10^(-5)mol/L多肽TAT-Q368-T379与吗啡联用组(N组)以及3×10^(-5)mol/L Cmpd101与吗啡联用组(O组),通过细胞免疫荧光染色法检测各组细胞的受体平均荧光强度。结果GloSensor cAMP生物传感器检测结果显示,C~F组细胞EC_(50)值差异有显著性(F=13.12,P<0.05),其中D、E、F组EC_(50)值较C组均显著减小(P<0.05)。蛋白质相互作用分析法分析显示,I~K组细胞E_(max)值差异有显著性(F=185.95,P<0.05),其中J、K组E_(max)值较I组均显著减小(P<0.01)。细胞免疫荧光染色法染色结果显示,L~O组细胞表面受体荧光强度比较差异有显著性(F=17.46,P<0.05),其中与M组比较,N、O组细胞表面受体荧光强度均显著增高(P<0.01)。结论基于MOR羧基端^(375)STANT^(379)磷酸化位点设计的多肽TAT-Q368-T379可有效增强吗啡介导的MOR下游G蛋白信号通路的激活,减少吗啡介导的β-arrestin2招募,从而减少由吗啡介导的MOR的内吞。