荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性

摘要

目的:开发一种可快速、灵敏地检测生物样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)含量的荧光分析方法.方法:根据APE1所具有的脱碱基核酸内切酶活性,合成了一种用荧光基团与猝灭基团标记的含脱碱基位点的DNA荧光探针.在合适的缓冲体系下,APE1将该DNA探针水解并释放出荧光基团,根据荧光信号上升速率实现对APE1活性的定量检测.在此基础上,本研究改进了检测APE1时溶液缓冲液的条件,使得该荧光探针对APE1的响应更为灵敏,并进一步通过密度梯度离心法从人全血样品提取了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用改进后的荧光探针法定量测定了其蛋白提取液中APE1的含量.最后,使用该荧光探针法测定了临床血液样本中APE1的含量.结果:本研究建立的方法对APE1的最低检测限和功能灵敏度均为0.005 U/mL(3 pg/mL),线性范围为6 pg/mL ～ 1.2 ng/mL.利用该方法测定了8份人血液样品中PBMCs蛋白中APE1的含量,测得每微克PBMCs蛋白中APE1的含量分布为0.061 ～0.40 ng,平均含量为0.16 ng APE1,加标回收率为98％±5％(n=3).用该方法对102份正常人(男51例、女51例,年龄59～75岁)血清样品中的APE1含量进行了检测,得到这些血清样品中APE1含量的分布范围为0.13 ～0.34 ng/mL,加标回收率为96％±15％(n=3).结论:本研究发展的荧光分析法操作简便、灵敏度高、所需生物样品量小,能够快速、准确地测定血液等生物样本中的APE1含量,解决了原有方法检测低含量血清样品时误差较大的问题,有良好的临床检验应用前景.