拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

摘要

[目的]构建拟南芥转录因子Do f1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体.[方法]利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Do f1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平.[结果]成功构建了拟南芥转录因子Do f1基因的原核表达载体pET32a(+)-Do f1,在28℃、1 mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42 ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体；Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应.[结论]成功实现了Do f1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Do f1基因的进一步研究奠定基础.