肿瘤坏死因子-α通过激活Wnt/β-catenin通路增加肺微血管内皮屏障通透性

摘要

目的 探讨炎症环境下Wnt/β-catenin通路对肺微血管内皮屏障通透性的影响。方法 分别用浓度为0、25、50、100、200 ng·mL^(-1)的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)处理人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMVECs)24 h,采用CCK-8检测细胞存活率,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测闭合蛋白-5(claudin-5)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1,ZO-1)的表达,选取TNF-α最佳干预浓度。将细胞分为control组、TNF-α 100 ng·mL^(-1)组、Wnt通路抑制对照组(XAV-NC组)、Wnt通路抑制组(XAV组),应用Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939(10μmol·L^(-1),24 h)后,采用CCK-8法检测细胞存活率,细胞划痕实验检测细胞迁移,FITC-葡聚糖检测微血管内皮屏障通透性,RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western blot)测定各实验组β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、claudin-5、ZO-1的表达。结果 随TNF-α浓度增加,HPMVECs存活率逐渐降低,claudin-5、ZO-1 mRNA表达逐渐减少(P均<0.05),筛选出TNF-α作用的最适剂量为100 ng·mL^(-1)。应用XAV-939后,与control组相比,TNF-α 100 ng·mL^(-1)组细胞存活率及迁移率降低,Transwell小室通过FITC-葡聚糖增多,屏障相对通透性系数增大,β-catenin及Cyclin D1表达增加,claudin-5、ZO-1的表达减少(P均<0.05);与XAV-NC组比,XAV组细胞存活率及迁移率增加,Transwell小室通过FITC-葡聚糖减少,屏障相对通透性系数减小,β-catenin及Cyclin D1表达减少,claudin-5、ZO-1的表达增加(P均<0.05)。结论 TNF-α可通过激活Wnt/β-catenin通路,使紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1的表达减少,增加肺微血管内皮屏障通透性。