含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

摘要

目的:构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy∶∶Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体,拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法:设计一对PCR引物,在引物的5'端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,以质粒pORF5-Fcy∶∶Fur为模板,采用常规PCR方法扩增Fcy∶∶Fur融合基因,并将其分别克隆进测序载体PCS2+及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy∶∶Fur融合基因从测序载体上切出,按正确阅读框架克隆进pLXSN中,重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果:序列测定表明,扩增的基因即为Fcy∶∶Fur序列,Fcy∶∶Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达;重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明:Fcy∶∶Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论:成功构建含有自杀基因Fcy∶∶Fur的逆转录病毒表达载体,为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。