Neuroligin-1细胞外域的表达、纯化与鉴定

摘要

目的 克隆神经连接蛋白-1(Neuroligin-1,NL-1)细胞外基因片段1-691aa(NL1/1-691),插入载体pGEx-6p-1,并进行表达、纯化与鉴定.方法 优化并常规合成基因NL1/1-691,添加5'BamHI和3'XhoI酶切位点,将基因通过5'BamHI and 3'XhoI酶切位点克隆至载体pGEX-6p-1(氨苄青霉素抗性)上,构建质粒pGEX-6p-1-NL1/1-691,筛选阳性克隆,转化至大肠杆菌C43感受态细胞中,蛋白质纯化筛选最佳诱导表达条件并获得目的蛋白;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)对蛋白进行鉴定.结果 经质粒双酶切鉴定、菌液PCR鉴定后,pGEX-6p-1-NL1/1-691原核表达载体构建成功.各个温度诱导下NL1/1-691蛋白均呈包涵体表达,表达优化后可将NL1/1-691从GST磁珠上纯化下来,得到部分可溶性蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白为带GST标签的目的蛋白NL1/1-691.结论 本实验室成功得到NL1/1-691重组蛋白,NL1/1-691最佳纯化条件为:37°C培养3 h加IPTG诱导为最佳诱导时机,IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L,最佳诱导时间为12 h.将其应用到后续实验,有望为阿尔兹海默病的治疗提供新的思路.