快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立

摘要

目的建立能直接快速应用于临床检测洋葱伯克霍尔德菌的巢式荧光定量PCR法。方法根据洋葱伯克霍尔德菌recA基因序列设计用于普通PCR扩增的外引物,同时设计用于荧光定量PCR的内引物。分别以洋葱伯克霍尔德菌等细菌的标准株为模板,以外引物进行第一轮PCR扩增;所得PCR产物为模板,以内引物进行染料法荧光定量PCR检测recA基因表达水平,评估巢式荧光定量PCR法的特异性。同时将洋葱伯克霍尔德菌的菌液和基因组DNA进行浓度梯度稀释,继续进行巢式荧光定量PCR,确定此方法的灵敏度。最后用巢式荧光定量PCR法和Vitek 2 Compact仪器分别鉴定35例临床标本,比较两者的检出能力。结果巢式荧光定量PCR法只针对洋葱伯克霍尔德菌有扩增曲线,而对其他菌株无检测信号。同时,巢式荧光定量PCR法的检测下限是1×10^1 CFU/mL的菌液和1×10^⁃5 ng/μL的基因组DNA,具有较高的灵敏度。巢式荧光定量PCR法能有效检测出14例临床标本存在洋葱伯克霍尔德菌感染(检出率为40.0%),而Vitek 2 Compact仪器仅检测出10例(检出率为28.6%),其中4例无法识别。结论巢式荧光定量PCR法具有有效、快速和直接应用于临床检测的优点,并且特异、灵敏和准确等特点,值得在临床推广。