目的建立小鼠慢性束缚应激(Stress)模型,探讨心理应激诱导活性氧(ROS)介导的食管紧密连接(TJ)蛋白表达以及在细胞间隙增宽(DIS)发生中的影响。方法20只雄性SPF级昆明小鼠随机分两组(每组10只),即慢性束缚应激(Stress)组和正常对照(Control)组。Stress组小鼠每天在自制式束缚器中限制活动2h,其余时间两组小鼠在相同环境中自由饮水摄食,实验持续14天。通过HE染色在光学显微镜下观察食管上皮组织病理学改变并进行间距测量。采用免疫组化方法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox-4)在小鼠食管中的表达,进一步通过酶联免疫吸附(ELISA)、蛋白质印迹(WB)法检测Nox-4蛋白表达量,并通过实时定量RT-PCR法检测食管组织中ROS指标(Nox-4、8-OHdG、MDA)、抗氧化蛋白(Nrf-2、HO-1)及TJ蛋白重要指标(Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1)mRNA的表达量。结果与Control组小鼠比较,Stress组小鼠体质量增加量低于Control组(7.95±2.45 vs 11.32±2.23),差异有统计学意义(t=3.78,P<0.01)。两组小鼠光镜下测量的平均细胞间隙分别为Control组0.71±0.18μm、Stress组1.18±0.12μm,与Control组比较,Stress组小鼠上皮细胞间距明显增宽,差异有统计学意义(P=0.000)。免疫组化结果显示,Nox-4主要表达于食管固有层、黏膜及黏膜下层,Stress组Nox-4阳性表达显著高于Control组。Stress组小鼠食管黏膜中Nox-4 mRNA相对表达水平是Control组的2.36±0.34倍,而Stress组血清Nox-4的释放浓度是Control组的2.25±0.27倍以上,差异有统计学意义(t=-11.56,P=0.000)。ELISA实验结果显示,Stress组小鼠8-OHdG(3.95±0.25 vs 1.65±0.38)和MDA(0.95±0.01 vs 2.48±0.20)的血清表达水平显著高于Control组,差异有统计学意义(t=-23.45,P=0.000)。抗氧化蛋白的RT-PCR实验结果显示,Stress组Nrf-2,HO-1的mRNA转录水平明显低于Control组的1.82±0.35倍,差异有统计学意义(t=-8.25,P=0.000);蛋白质印迹法检测显示,Stress组小鼠食管组织中Nrf-2、HO-1蛋白表达水平显著低于Control组。食管上皮组织TJ蛋白重要指标的RT-PCR实验结果显示,Stress组TJ蛋白Claudin-1、Claudin-4、Occludin及ZO-1的mRNA转录水平显著降低,分别是Control组的1.67±0.28、1.54±0.22、1.85±0.35、1.74±0.42倍,差异有统计学意义(t=-8.34、-14.78、-17.63、-12.27,P=0.000)。结论心理应激可能直接通过破坏食管氧化/抗氧化系统平衡,引起TJ蛋白的表达异常以及DIS的产生。
展开▼
