shRNA-Bmi1重组载体构建及其对胆囊癌裸鼠移植瘤hTERT表达的影响

摘要

目的体外构建及鉴定sh RNA-Bmi1重组载体,探讨靶向沉默原癌基因Bmi1对人胆囊癌细胞Bmi1m RNA表达、蛋白表达及对裸鼠皮下移植瘤h TERT表达的影响.方法针对Bmi1不同位点构建4个sh RNABmi1重组质粒,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和Western blot检测各组Bmi1m RNA和蛋白表达,选择有效干扰组进行体内实验.构建GBC-SD裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为sh RNA-Bmi-4组（实验组）、sh RNA-Scramble（错配组）,Lipofectamine（阴性对照组）,GBC-SD（空白对照组）.成瘤后进行移植瘤治疗,治疗6周后处死裸鼠,免疫组化检测裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达水平.结果成功构建了sh RNA-Bmi1重组载体.转染胆囊癌48 h后倒置荧光显微镜观察发现sh RNA-Bmi1-4组GBC-SD绿色荧光强度增强、转染效率最高,RT-PCR及Western blot结果显示sh RNA-Bmi1-4组m RNA及蛋白表达量均明显低于各对照组（P〈0.05）,对照组间表达量差异无统计学意义（P〉0.05）.选取sh RNA-Bmi1-4组作为有效干扰序列作后续体内实验.免疫组化检测sh RNA-Bmi-4组裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达水平明显低于各对照组（P〈0.05）,对照组间蛋白表达量差异无统计学意义（P〉0.05）.结论体外成功构建了sh RNA-Bmi1重组载体,顺利进行重组载体的转化和转染实验。靶向沉默Bmi1基因可有效促进胆囊癌细胞Bmi1m RNA降解、抑制其蛋白的表达,同时有效抑制GBC-SD裸鼠移植瘤h TERT蛋白表达.