沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及抗氧化应激的影响(摘要)

摘要

目的鉴定G6PD缺陷型人皮肤黑色素瘤稳转细胞株;观察其生长增殖及对Diamide、H2O2或UV诱导的氧化应激反应;比较与外源性抑制G6PD剂作用的异同;探讨G6PD与肿瘤细胞生长和抗氧化应激的关系.方法通过荧光显微镜观察GFP表达的稳定性、Western blotting检测G6PD蛋白表达量和紫外法测定G6PD比活性,以鉴定G6PD缺陷型人皮肤黑色素瘤A375稳转细胞株(A375-G6PD△);MTT法、平板克隆法和流式细胞仪(FCM)检测观察A375-G6PD△与野生细胞(A375-WT)生长增殖能力和凋亡率的差异;比较两种细胞对巯基氧化剂二酰胺(Diamide)处理后细胞存活率以及NADPH、GSH和H2O2指标的改变;通过FCM对比Diamide、H2O2或UV处理前后A375-G6PD△和A375-WT细胞凋亡率和凋亡蛋白(P53、Bcl-2、Casepase-3)的变化;并观察G6PD非竞争抑制剂DHEA协同Diamide作用与Diamide单独作用相比,两种细胞抗氧化能力和凋亡结果的异同.结果通过反复冻存及多次传代,A375-G6PD△的GFP荧光表达稳定,与A375-WT相比,G6PD表达降低了88.8%,比活性减少了78.5%;A375-G6PD△的生长速度比A375-WT减慢了24.4～37.5%,单细胞克隆形成率也降低25%,凋亡率增加了40%;A375-G6PD△和A375-WT的Diamide半致死量分别为1.2mM和1.8mM;用1.8mMDiamide处理后,与A375-WT相比,A375-G6PD△的NADPH和GSH下降了2.4倍和8.8倍,H2O2增加了7.3倍;FCM检测的凋亡结果显示,A375-G6PD△在Diamide、H2O2或UV作用后,较A375-WT的凋亡率增加了1.8倍、1.7倍和1.1倍;与A375-WT相比,A375-G6PD△在Diamide处理后P53下降2.3倍、Casepase-3升高2.5倍,而在UV作用后P53增加1.4倍;两种细胞Bcl-2的水平在Diamide、H2O2和UV作用后均有所下调;此外,DHEA对A375-G6PD△和A375-WT的G6PD比活性的抑制程度相近,在Diamide联合DHEA的作用后的凋亡数值也相似,二者的P53表达均降低约60%、Casepase-3增加近1倍.结论 A375-G6PD△是稳转的G6PD缺陷人皮肤黑色素瘤细胞株;沉默G6PD表达可减慢A375细胞生长增殖速度,与外源性G6PD抑制剂DHEA作用相似,都能使A375细胞对氧化应激诱导的凋亡更敏感.这说明G6PD不仅能促进人皮肤黑色素瘤细胞的生长增殖,也对调节该肿瘤细胞内由ROS所致的氧化--抗氧化失衡起重要作用.