罗非鱼脯氨酸内肽酶的分离及抑制剂对其的作用机制

摘要

采用硫酸铵盐析及柱层析技术,从罗非鱼肌肉中分离纯化得到分子质量约为85 ku的脯氨酸内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)。通过肽质量指纹质谱分析,获得13个肽片段,含128个氨基酸残基,结果显示,与伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)的PEP完全一致。该酶特异分解荧光底物Suc-Gly-ProMCA和Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MCA,PEP特异性抑制剂SUAM-14746和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF可以抑制该酶的活性。PEP催化Suc-Gly-Pro-MCA水解反应的活化能(Ea)为47.42 k J/mol。SUAM-14746对PEP表现为竞争性抑制作用,抑制常数(KI)为1.91μmol/L。金属离子Zn^(2+)和Cu^(2+)对PEP的抑制类型均为混合型抑制,其中对游离酶的抑制常数(KI)分别为1.80 mmol/L和0.07 mmol/L,对酶-底物络合物的抑制常数(KIS)分别为2.33 mmol/L和1.17 mmol/L。