mTOR磷酸化水平对成骨MC3T3E1细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制

摘要

目的:通过雷帕霉素(RAPA)和MHY1485抑制和激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化,探讨磷酸化mTOR(p-mTOR)水平变化对成骨细胞增殖、自噬和分化的作用及其机制.方法:小鼠成骨MC3T3-E1细胞分为对照组、20 nmol·L-1 RAPA组、60 nmol·L-1RAPA组、160 nmol·L-1 RAPA组和2.0μmol·L-1 MHY1485组.流式细胞术检测各组不同细胞周期MC3T3-E1细胞百分率,Western blotting和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中mTOR及下游真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)和核糖体S6激酶1(S6K1)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Caspase-3、碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx2)和成骨相关转录因子Osterix的表达水平,茜素红染色观察各组成骨MC3T3-E1细胞矿化能力.结果:与对照组比较,20和60 nmol·L-1 RAPA组细胞增殖活性升高(P<0.05或P<0.01),G1期细胞百分率降低(P<0.05或P<0.01),S期细胞百分率升高(P<0.05或P<0.01),细胞中p-mTOR及其下游通路磷酸化4E-BP1(p-4E-BP1)、磷酸化S6K1(p-S6K1)水平和p62、Bax、Cleaved-Caspase-3表达水平降低(P<0.05或P<0.01)、LC3-Ⅱ、Bcl-2、ALP和Runx2表达水平升高(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,160 nmol·L-1 RAPA组细胞增殖活性降低(P<0.01)、细胞中p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1水平明显降低(P<0.05或P<0.01),2.0μmol·L-1 MHY1485组细胞增殖活性明显降低(P<0.01),细胞中p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K1水平明显升高(P<0.01),160 nmol·L-1 RAPA和2μmol·L-1 MHY1485组细胞中Bax和Cleaved-Caspase-3表达水平升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2、ALP、Runx2和Osterix表达水平降低(P<0.05或P<0.01);作用12 d后,20和60 nmol·L-1 RAPA组细胞中可见明显矿化结节,160 nmol·L-1 RAPA和2.0μmol·L-1 MHY1485组成骨细胞中见极少数钙盐结晶.结论:轻中度抑制mTOR的磷酸化可促进成骨细胞增殖、自噬和分化,而过度抑制和增强mTOR磷酸化则具有相反作用.