匹鲁卡品致小鼠癫痫神经元模型的建立及其F-actin、Calponin 3和ROCK2的表达

摘要

目的:探讨匹鲁卡品所致小鼠癫痫神经元中细胞骨架丝状肌动蛋白(F-actin)、调宁蛋白3(Calponin 3)和Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)的表达,研究癫痫发作后RhoA/ROCK2通路与Calponin 3和F-actin解聚和重构之间的关系.方法:采用木瓜蛋白酶消化法分离ICR新生小鼠乳鼠皮层神经元,生长至第7天时用微管关联蛋白2 (MAP2)抗体进行免疫组织化学染色鉴定神经元.将培养7d的神经元分为对照组和癫痫模型组,对照组用神经元培养基培养,癫痫模型组在神经元培养基中分别加入终浓度为2、3和4 mmol·L-1匹鲁卡品,24 h后换为正常培养基.分别在造模后不同时间点取出各组细胞固定,进行免疫组织化学染色和荧光染色.采用Alex-546标记的phalloidin进行荧光染色观察神经元中F-actin分布;免疫组织化学染色观察神经元中Calponin 3、ROCK2和磷酸化ROCK2 (p-ROCK2)表达和分布.结果:光镜下观察和F-acitn荧光染色,与对照组比较,造模24 h后,2 mmol·L-1匹鲁卡品组细胞无明显变化;3 mmol·L-1匹鲁卡品组神经元中F-acitn出现解构,神经元部分突起消失,但在更换正常培养基后,细胞形态和F-actin结构在造模7d后逐渐恢复;4 mmol· L-1匹鲁卡品组神经元中F-actin结构崩解破坏严重,神经元突起不可逆性消失.免疫组织化学染色,对照组Calponin 3和ROCK2弥散分布于胞质中;在造模1d时癫痫模型组(3 mmol·L-1匹鲁卡品)神经细胞中Calponin 3和ROCK2明显聚集在细胞膜下方,随培养时间延长其表达量明显上调,位于细胞膜下方的p-ROCK2表达量也较对照组明显增加,同样随培养时间延长其表达量逐渐升高.结论:利用3 mmol·L-1匹鲁卡品成功建立癫痫神经元模型.3 mmol·L-1匹鲁卡品可使神经元细胞内ROCK2活化为p-ROCK2,并上调神经元内的ROCK2和p-ROCK2表达量,促使F-actin解聚导致神经元突起部分消失,p-ROCK2激活Calponin 3磷酸化,促进F-actin重构和神经元形态结构的恢复.