人烯醇化酶1在原核细胞中的可溶性表达及纯化

摘要

目的用原核表达系统生产人烯醇化酶1(ENO1),为筛选抑制剂奠定基础。方法通过5′分别带Nde I和Xho I位点的一对引物PCR扩增ENO1 cDNA,用Nde I+Xho I酶切cDNA和质粒pET-28a。酶切产物经纯化后用T4 DNA ligase连接,并转化大肠杆菌Top10,用含卡那霉素的LB平板(LBK培养基)筛选转化子。提取转化子质粒,酶切和测序法鉴定。将序列正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用LBK培养基培养抗性菌落至OD_(600)约为0.7,加入终浓度0.2mmol/L IPTG,16℃诱导ENO1表达20h。超声破碎收集的菌体离心取上清,用组氨酸标签蛋白(可溶性)纯化试剂盒纯化ENO1。对纯化的ENO1进行超滤浓缩和缓冲液交换后,BCA法测定浓度,低温保存。结果ENO1正确连入pET-28a,重组菌pET-28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导后,从裂解液上清中获得了高纯度的ENO1,产量达427mg/L。结论高产量、高纯度可溶性ENO1奠定了抑制剂筛选模型建立的基础。