致病蛋白Htt-exon1在大肠杆菌中表达及铜离子结合能力的检测

摘要

含有过度延长的氨基末端谷氨酰胺重复序列(polyglutamine,polyQ)的Htt-exon1具有神经毒性,导致亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease,HD),研究表明HD病人脑内有过度积累的铜离子,但机制不明。为了探索铜离子与Htt-exon1的关系,文章利用基因工程技术,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出含有10个polyQ的Htt-exon1 polyQ10和含有42个polyQ的毒性蛋白Htt-exon1 polyQ42,克隆至pGEX-6p-2原核表达载体上,在大肠杆菌BL21中表达,异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达出融合蛋白GST-Htt-exon1并分离纯化出Htt-exon1 polyQ10和Htt-exon1 polyQ42,样品硝化后用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma masss pectrometry,ICP-MS)检测Htt-exon1结合铜离子的量。结果表明:分离纯化后的GST-Htt-exon1 polyQ10分子量为40 kDa左右,GST-Htt-exon1 polyQ42分子量为50 kDa左右,经PP酶切割掉GST标签后,通过Western Blot进一步验证,纯化后的Htt-exon1 polyQ10分子量为8.5 kDa,Htt-exon1 polyQ42分子量为12.5 kDa,与预期一致;并利用ICP-MS检测发现,Htt-exon1 polyQ10和Htt-exon1 polyQ42均具有结合铜离子的能力。