人MAPK3基因原核表达载体的构建及鉴定

摘要

目的探讨人丝裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)基因原核表达载体的构建及鉴定。方法取对数生长期正常人肝细胞系HL-7702细胞,采用TRIzol法抽提细胞总RNA,以此为模板用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)反转录扩增MAPK3基因的蛋白编码区,脱氧核糖核苷酸(DNA)测序鉴定后插入原核表达载体pGEX-4t-1中构建重组原核表达质粒(命名为pGEX-MAPK3_(GST));将pGEX-MAPK3_(GST)导入细菌Rosetta(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用Sepharose 4B亲和层析法纯化MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用考马斯亮蓝染色和蛋白免疫印迹分析GST-MAPK3的蛋白纯度和验证目的蛋白。结果RT-PCR法成功克隆了人MAPK3基因的蛋白编码区,DNA测序结果显示该片段无任何突变;用克隆获得的基因片段成功构建了pGEX-MAPK3_(GST),通过原核表达的方式获得了GST-MAPK3,并通过亲和层析纯化了GST-MAPK3。结论成功克隆人MAPK3基因并获得MAPK3蛋白,可用于体外研究MAPK3对细胞角蛋白18(CK18)的磷酸化作用。