锯缘青蟹凝集素的提取及单克隆抗体制备

摘要

凝集素是无脊椎动物非特异性免疫系统的重要组成成份,可凝集外来病原菌、进行非己识别、调理和介导血细胞吞噬.开展了锯缘青蟹血清凝集素的提取、单克隆抗体制备及凝集素定位研究,以N-乙酰基葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine,GlcNac)为配基制备了Sepharose 4B亲和层析柱,可选择性结合青蟹血清凝集素;青蟹血清通过亲和层析柱后,以0.45 mol/L NaCl洗脱,得到有较高凝集活性的单一洗脱峰,该洗脱峰凝集素比活为血清凝集活性的32.6倍,SDS-PAGE显示存在87 ku和79 ku主要蛋白成分;以纯化青蟹凝集素免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、单抗筛选获得BP8-2等7株可稳定分泌抗凝集素单抗的小鼠杂交瘤细胞株,单抗腹水的ELISA效价为1:104～1:105;单抗可特异性抑制青蟹凝集素的血凝,血凝抑制效价为1:32～1:64,亚型鉴定表明7株单抗均为IgGl型,免疫印迹表明单抗可特异性结合87 ku、79ku蛋白;采用凝集素单抗间接免疫荧光法进行了青蟹血淋巴细胞染色,结果显示凝集素主要分布于颗粒细胞的细胞质颗粒和透明细胞的细胞膜上.