腺病毒介导人凝血因子IX基因在小鼠脂肪干细胞中的表达

摘要

目的:探讨腺病毒介导的人凝血因子IX(hFIX)基因在小鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中的表达。方法:体外分离培养小鼠脂肪干细胞,观察其细胞形态,CCK-8法测定其生长活力,流式细胞术鉴定其细胞表型CD29、CD90、CD45,成脂成骨诱导鉴定其分化能力。将携带hIX基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞,对比观察其与未转染时细胞形态及生长曲线有无变化。RT-PCR检测hFIX基因在细胞中的表达,Western blot检测细胞内及培养细胞上清液中hFIX蛋白的表达。ELISA法检测细胞上清液中的hFIX蛋白量(The antigen content of hFIX,FIX:Ag),一期法检测培养细胞上清液中hFIX蛋白活性(The clotting factor activity of hFIX,FIX:C)。结果:小鼠ADSC离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形,具有很强的折光性,贴壁生长时间为种瓶后4-6 h,种瓶后72 h细胞变为长梭形纤维状,呈漩涡状排列;第3代ADSC体外培养1-2 d生长速度较缓慢,3-5 d增殖速度增快,呈指数倍扩增,6-7 d生长速度逐渐缓慢,总体生长趋势呈S型;油红O对诱导后细胞进行染色,用倒置显微镜观察,可见红色脂滴形成。茜素红对诱导后细胞进行染色,用倒置相差显微镜观察,可见橙红色钙化骨节。第3代ADSC高表达CD29(99.91%),CD90(99.02%),几乎不表达CD45(0.94%)。RT-PCR结果显示,hFIX基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达。Western blot结果显示,小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达hFIX蛋白。ELISA测定转染ADSC培养上清FIX:Ag:第1 d为21.33±3.93 ng/(10^6 cells·24 h),第3 d为12.63±0.86 ng/(10^6 cells·24 h),第9 d为12.63±2.36 ng/(10^6 cells·24 h)。一期法检测培养细胞上清液中FIX:C为8.5%。结论:携带hFIX基因的腺病毒能有效转染ADSC。hFIX基因修饰的ADSC可以分泌具有凝血活性的hFIX蛋白。