利用单个细胞RT-PCR法克隆全人源性HBV单克隆抗体的探讨

摘要

目的 建立外周血单个抗体分泌细胞分离和单个细胞RT-PCR系统,高效快速克隆高度特异性、全人源性的HBV单克隆抗体.方法 选择3例HBV感染恢复期患者,从外周血中富集B淋巴细胞,加入HBcAg Peptide pool活化B淋巴细胞,流式分选出记忆性抗体分泌细胞(CD19+ CD10-IgG+ CD27+),通过有限稀释法获得单个细胞,单细胞RT-PCR反转出cDNA,巢式PCR扩增抗体重链恒定区序列片段,将PCR产物纯化并克隆至pEASY(R)-T1 simple克隆载体,进行测序鉴定.结果 ELISA结果显示,3例HBV感染恢复期患者血浆中均检测到较高水平IgG,与健康志愿者相比,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).流式结果显示,B淋巴细胞比例均高于94％,且均可分离出记忆性抗体分泌细胞.从分离的抗体分泌细胞中挑选出24个含有1个形态完好的细胞,经鉴定,其中有14个扩增成功,且条带在200 bp左右,与预期片段大小相符.对抗体重链序列分析显示成功扩增出抗体恒定区片段.结论 成功构建了单个抗体分泌细胞分离和单个细胞RT-PCR系统,获得了抗体重链序列,为后期全人源性乙型肝炎单克隆抗体的高通量生产打下了坚实的基础.