基于冷冻透射电镜电子断层扫描技术对适用于原位解析真核细胞核糖体结构的样品厚度研究

摘要

目的:基于冷冻透射电镜电子断层成像和子断层平均技术,比较不同厚度样本中原位解析的核糖体超微结构分辨率,探究样品厚度与颗粒数量对解析原位结构分辨率的影响.方法:通过300 kV冷冻透射电镜对快速冷冻制备的PC12+细胞样本进行连续断层扫描和三维重构,根据三维重构后的神经膨起厚度分为四组(100+nm、200+nm、300+nm和400+nm),采用EMAN2.3实现核糖体在胞内的可视化、数量分布与类型表征.用子断层平均重构技术计算各组核糖体分辨率,并采用Chimera软件对核糖体结构进行模型拟合.结果:各组间以200+nm核糖体颗粒分辨率最高,达到1.67 nm(11781个颗粒)和1.78 nm(6000个颗粒),100+nm组其次.研究还发现,在400 nm样品厚度范围内,核糖体颗粒数量越多,解析出的核糖体结构分辨率越高.结论:对于经NGF诱导分化的PC12+细胞膨起来说,<400 nm厚度的断层扫描数据均可用于核糖体结构的原位高分辨解析,且以200～300 nm最为合适.